В объятиях XX-го века. Воспоминания

Миша сказал, что будет любить Олю до самой березки. Я поверила.

Ближе к осени в Москве в 1978 году состоялся 14-ый Международный Генетический конгресс. Долгих 40 лет его ждали отечественные генетики. Многие не дождались.

Съехалось много знаменитостей, в том числе и из Америки. Наверное, было не менее двух тысяч его участников. Заседания проходили, в основном, в Главном здании Московского университета. Часто на заседания мы ходили вместе с Олечкой, одетой в моё платье. В свои она уже не помещалась. Приехали и европейские коллеги-актиномицетчики, в их числе и Кит Четер. С ним мы обсуждали детали готовящегося к печати совместного обзора по генетике и молекулярной биологии бактериофагов Streptomyces. Обзор был опубликован в американском журнале Microbiological Review, 1980, vol. 44, p. 206–229. Его соавторами были Ломовская Н. Д. и Мкртумян Н. М. (Lomovskaya N., Chater K., Mkrtumian N.).

Заключительное заседание съезда проходило в кремлевском дворце съездов. После заседания состоялся грандиозный банкет. Помню сидящего в кресле Николая Владимировича Тимофеева-Ресовского, поздороваться с которым выстроилась большая очередь из иностранцев. На следующий день вся наша актиномицетная компания поехала на экскурсию в бывшую усадьбу Голициных, а впоследствии Юсупова, Архангельское. Кто ее организовал, не помню. Провели там целый день, утомились и проголодались.

Вечером добрели до ресторана. Там в отдельном кабинете нас ждал роскошный стол с блюдами русской национальной кухни. Кто за это все платил, не помню. Ели, пили, много танцевали. Злые языки потом говорили, что Кит Четер даже опоздал на утренний самолет домой в Англию.

В это время Том Труст уже приехал в Москву из Вашингтона и стал работать в нашей лаборатории. Решили, что он присоединится к исследованию, начатому Валерием Даниленко, по идентификации генетических признаков плазмиды SCP2, изолированной из штамма Streptomyces coelicolor A3(2) в лаборатории Д. А. Хопвуда. Том нам всем очень нравился, работал четко, ни на что не жаловался, несмотря на то, что, наверное, вся обстановка была для него более, чем необычной. Жил он в маленькой тесной комнатке в гостинице на Мичуринском проспекте, часто, как и все мы, ходил пешком по грязной дороге в институт в больших ботах, надетых на ботинки. Его семья была родом из Эстонии, но он всегда твердо говорил, что он не эстонец., а американец. Зима 1978 года была очень суровой и холодной. В самые холодные дни под Новый 1979 год он поехал в Эстонию навестить своих родственников. Когда я приглашала его в гости к себе домой, там обязательно должен был присутствовать кто-то из официальных лиц. Жили мы с ним по соседству. Добираться до работы и обратно надо было с пересадками на трех троллейбусах. Часто после работы брали такси у метро Варшавская, доезжали до моего дома, я расплачивалась и давала ему еще один рубль, и он на этой же машине ехал к себе домой. Такси тогда еще стоили дешево.

Денег, наверное, у него было немного. Довольно часто он ездил в Американское посольство на Садовой, рассказывал, что оно обставлено старинной и очень красивой мебелью. Мне иногда казалось, что вернувшись в Америку, он напишет свои впечатления о жизни в Москве. Но он, слава богу, ничего не написал, и я ему была очень благодарна. Как-то он мне вскользь упомянул, что все, что он слышит здесь по радио, наверное, вещание на заграницу, т. к. русского языка он не знал, – сплошная пропаганда. Да, еще он рассказывал, что его мать – очень опытный врач, постоянно повышает свою квалификацию, следит за научными открытиями в своей области.

Единственное, что меня очень утомляло во время его пребывания, это постоянное ощущение слежки. Как ни странно, после общения с ним в течение целого года мой разговорный английский почти не улучшился, т. к. общение, в основном, касалось научных проблем. В конце его годового визита мы написали большую статью, и она была опубликована в американском журнале Journal of Bacteriology, 1979, v. 140: 359–368.Соавторами статьи были Т. Р. Труст, В. Н. Даниленко и Н. Д. Ломовская. Был материал и для второй статьи, и ее даже написали, но решили, что надо еще кое-что проверить и не стали посылать для публикации. В моей памяти и в памяти сотрудников нашей лаборатории Том остался как прекрасный человек и опытный и удачливый экспериментатор.

Когда я приехала в Америку в 1991 году, Арнольд Демейн организовал мне турне с лекциями в ряде американских университетов и фармакологических фирм. В. Вашингтоне меня встречал Эдвард Кац, бывший руководитель Тома Труста. После моей лекции в университете, в котором он работал, он, ничего не говоря, привез меня в дом Тома Труста. Оказалось, что Том практически сразу после приезда из Москвы полностью сменил свою специальность, получив медицинское образование. Он стал крупным хирургом-отолярингологом, имел уже очень симпатичную жену и троих детей. Мы прекрасно провели время в его доме с коллегами из лаборатории Эдварда Каца. Так я еще раз повидалась с Томом Трустом. С. Эдвардом Кацем переписывались, когда уже приехали в Америку, и вдруг я получаю письмо от его жены Ольги, что он неожиданно скончался от сердечного приступа. Ушел из жизни прекрасный, доброжелательный человек, известный ученый и педагог.

Как-то не очень давно мне рассказала Оля, что сын А. А. Нейфаха и Елены Лазовской, близкой Олиной подруги, Илья должен был оперироваться у отоляринголога. Жил и работал в то время Илья в Вашингтоне. Когда он пришел на консультацию к хирургу, первое, что тот у него спросил, не знает ли он Наташу Ломовскую. Хирургом оказался Том Труст. Илья сказал, что знает, но больше знаком с Ольгой Ломовской. Том сказал, что он знает и Ольгу. Я чувствую свою вину перед Томом в том, что столько лет не давала о себе знать в суматохе вживания в новую жизнь и даже не уверена, что он знает, что мы уже давно живем в Америке. Мне представляется, что у него остались незабываемые впечатления о времени, проведенном им в Москве почти 40 лет тому назад. Вот какие в жизни бывают приятные неожиданности. За всю жизнь их, может быть, можно на пальцах пересчитать. Я сразу же написала Тому большое письмо. Он мне ответил, написал о себе и своей семье, вспомнил о нашей последней встрече в его доме в Вашингтоне, пригласил в гости в случае, если я окажусь поблизости.

Вернусь в 1978 год. Моя мама с присущим ей талантом уже несколько лет как поменяла квартиру на Филях на большую квартиру на Молодежной улице около метро Университет с видом на главное здание МГУ и университетские часы. На работу на биофак даже иногда ходила пешком. В 1978 году, по состоянию здоровья, ей пришлось уйти на пенсию, о чем она очень жалела всю оставшуюся ей жизнь. В ожидании Олиного ребенка она героически предложила нам с молодой семьей въехать в их большую квартиру, а самой с папой поехать жить к нам в Беляево. Мы, конечно, согласились и, как обычно, перевезли их с квартиры на квартиру. Лёня был почти профессиональным организатором всех наших переездов. Прожили они в Беляево недолго. Мама выменяла нашу маленькую трехкомнатную квартиру в Беляево путем сложного многоступенчатого обмена на прекрасную большую двухкомнатную квартиру в соседнем с нами доме по Молодежной улице, на которую смотрели окна нашей спальни. Так мы стали жить совсем по соседству.

9 ноября 1978 года у Оли с Мишей родилась дочка. Назвали Анной в память Олиной и Мишиной бабушек. Обеих звали Аннами. Нам это имя очень нравилось. Три года жили все вместе. Оля взяла академический отпуск в университете, быстро научилась готовить, часто кормила всю семью, хотя это было совсем не просто. По вечерам Оля с Мишей всегда уходили, говоря нам: «ну вы же все равно сидите дома». Я с Анечкой много гуляла по субботам и воскресеньям, и она стала громко называть меня бабой. Мне было только 43 года, и Оля научила ее звать бабушку и дедушку «Татик» и «Лёник». Так мы с Лёней и остались для Ани и Оли под этими смешными именами.

Оля серьезно тренировалась в университетской команде по бадминтону, и тренер предлагал ей подумать о спортивной карьере, но она, поразмыслив, выбрала все-таки научную. В 1979 году, отсидев положенное с Аней время на подмосковной даче, мы с Лёней достали по блату путевки в дом отдыха завода им. Хруничева на Рижском взморье. Отдохнули прекрасно, купались в бассейне с минеральной водой.

В самом конце 1979 года Лёня защитил докторскую диссертацию, чем окончательно завоевал уважение своей тёщи. Защита проходила в нашем институте, т. к. среди тестов на безопасность лекарств значительное место составляли тесты на микробах в качестве первичной оценки наличия или отсутствия у них мутагенной активности. Чудом у нас сохранился автореферат его диссертации, и поэтому я знаю ее название:

«Исследование мутагенного действия лекарственных препаратов и других биологически активных соединений с помощью микробных тест-систем».

Работа заведующего отделом безопасности лекарств была очень напряженной и ответственной. Ошибки совсем не допускались, т. к. речь шла об их влиянии на здоровье людей. У Лёни было довольно много недоброжелателей, как среди крупных ученых, претендующих на главную роль в области этого важного в теоретическом и прикладном плане направления исследований, так и среди авторов лекарств, которые не получили положительной оценки на безопасность. В отделе оценки безопасности лекарств в институте Л. А. Пирузяна, которым заведовал Лёня, были сосредоточены крупные силы по комплексной оценке безопасности лекарств. Отдел состоял из семи больших лабораторий. В это время были выпущены методические указания по оценке безопасности лекарств, которые до сих пор используются и цитируются учеными в России, работающими в этом направлении. На защиту приехал Л. А. Пирузян. Оппонентами у Лёни были С. Г. Инге-Вечтомов, А. С. Кривицкий и Г. Д. Засухина. Ленинградские генетики во главе с С. Г. Инге-Вечтомовым всегда поддерживали Лёню и давали высокую оценку его работам. Защита прошла успешно. Черных шаров никто не бросил. Коллег и друзей собрали, как всегда, у нас дома в 1-ый день 1980 года. Всем объявили, что будут только легкие вина и фрукты, т. к. все наверняка переели и перепили накануне при встрече Нового года. Столы, полные еды, накрыли в самой большой комнате нашей квартиры и плотно закрыли дверь. В столовой действительно выставили вина и фрукты. Шутка была не новая, но все купились и через короткое время поскучнели. Мы не стали долго испытывать терпение наших дорогих гостей, и все с большим удовольствием сели за нарядный банкетный стол.

Одна из редких фотографий Н. Д. Ломовской, сделанных на работе в институте ВНИИ генетика с 1968 по 1992 годы.

Генетический конгресс в Москве 1978 г. В центре Э. С. Пирузян, справа Н. Д. Ломовская.

Глава 19

Итоги работы сотрудников лаборатории актиномицетов и актинофагов

Теперь мне хотелось бы, по возможности кратко, подвести итоги продолжавшихся почти четверть века исследований во время моей работы в лаборатории генетики актиномицетов и актинофагов, а также вспомнить сотрудников, в то время работающих в нашей лаборатории.

Стремительно развивающаяся генетика и молекулярная биология бактерий уже продемонстрировала, какую важную роль играют бактериофаги (главным образом, умеренные) в изучении модельных бактериальных штаммов, таких, например, как E.coli, Salmonella thyphimurium и другие. При этом совершенно необходимым этапом являлось генетическое изучение самих бактериофагов, о котором уже были опубликованы большие обзоры и целые книги. Актинофаг phiC31 мог бы сыграть такую же важную роль в изучении актиномицетов, образующих большинство используемых в медицине и ветеринарии антибиотиков.

Как я уже упоминала, результаты по генетическому изучению актинофага phiC31 и первичному изучению его ДНК были подробно описаны в большом обзоре «Genetics and Molecular Biology of Streptomyces bacteriophages» («Генетика и молекулярная биология Streptomyces бактериофагов»), опубликованном в американском журнале Microbiological Reviews, June 1980, p. 206–229. Авторами обзора были Н. Д. Ломовская, К. Ф. Четер и Н. М. Мкртумян. В этот обзор вошли данные по генетическому изучению и физической характеристике генома актинофага phiC31, полученные в нашей лаборатории в период между 1968 и 1979 годами.

Первые данные по изоляции и изучению фага phiC31 были получены Норой Манвеловной Мкртумян, Натальей Львовной Гостимской и мной. Мы с Норой Манвеловной были первыми в нашей лаборатории и проработали вместе с 1968 по 1992 годы, вплоть до моего отъезда в Америку. В 70-ые годы она опубликовала не менее десятка работ, посвященных генетическому изучению актинофага phiC31. Нору в лаборатории все любили. Она создавала особый климат во взаимоотношениях между сотрудниками лаборатории. Кроме того, она была прекрасным профессиональным переводчиком с русского на английский, что было редкостью. Норины переводческие способности необычайно способствовали появлению наших статей в англоязычных журналах в Америке и Англии. Работать вместе с ней над ее переводами было одно удовольствие. Условием посылки статей за рубеж была их предварительная публикация сначала в отечественных журналах. Кроме того, статья должна была пройти через ряд экспертных комиссий как в институте, так и в министерстве. Поэтому публикация за рубежом требовала значительных усилий, и проходил большой срок от получения результатов до появления их в зарубежной печати. В какое-то время мы даже перестали посылать статьи за рубеж, и наши иностранные коллеги говорили с юмором, что собираются учить русский. Но не собрались.

Почти одновременно с Норой в лабораторию пришли Н. Л. (Наташа) Гостимская и чуть позже Лидия Константиновна (Лида) Емельянова, Татьяна Александровна (Таня) Чиненова, Татьяна Александровна (Таня) Воейкова – все молодые выпускники Московского университета, а также дипломник кафедры генетики МГУ. Валерий Николаевич (Валерий) Даниленко. С ними со всеми мы проработали в лаборатории долгие годы. Правда, в современном послужном списке В. Н. Даниленко это не упоминается.

Нашими первоочередными задачами по генетическому изучению фага phiC31 было получение количественных параметров инфекции чувствительных к актинофагу вариантов штамма Streptomyces coelicolor А(3)2 и индикаторного штамма S.lividans 66 в одноступенчатом цикле развития (ОЦР) фага, когда оценивается количество фаговых частиц, освобождающееся из каждой инфецированной клетки. Путь к получению количественных параметров процесса инфекции оказался достаточно тернистым.

Получение количественных оценок в опытах ОЦР является основой всех генетических эеспериментов. Эта задача осложнялась несинхронным прорастанием спор актиномицетов, что затрудняло определение стадии развития актиномицетного штамма, чувствительной к фаговой инфекции. После преодоления ряда методических трудностей актинофаг phiC31 был охарактеризован в количественном отношении как умеренный фаг, способный к лизису и лизогенизации. Были оценены число фаговых частиц, образующихся при лизисе одной инфецированной прорастающей споры, частота лизогенизации чувствительных штаммов, параметры спонтанного и индуцированного образования фага лизогенными культурами (журн. Генетика, 1971, том 7, стр. 108–112 и J. Virology, 1972, v. 9: 258–262). Авторами первой статьи были Н. Д. Ломовская и Н. М. Мкртумян, а второй – мы же и соавторы, Н. Л. Гостимская и В. Н. Даниленко. Представляется, что прежде такие параметры процесса инфекции и образования фага лизогенными культурами не были известны ни для одного из изучаемых актинофагов.

Наташей Гостимской и Таней Чинёновой в процессе получения и характеристики с-мутантов актинофага phiC31, не способных к поддержанию лизогенного состояния и образующих прозрачные бляшки в отличие от мутных, образуемых фагом дикого типа, были изолированы cts-мутанты, которые являлись с-мутантами только при высокой температуре. Лизогены, содержащие в качестве профага cts-мутант были использованы, в частности, как удобная модель для более точного определения стадии в развитии актиномицета, чувствительной к фаговой инфекции. Н. Л. Гостимской (теперь уже Н. Л. Новиковой) с соавторами О. Н. Капитоновой и Н. Д. Ломовской (ж. Микробиология, 1973, том 17, стр. 713–718) были осуществлены эксперименты по термоиндукции (краткая инкубация при высокой температуре) лизогенов, несущих в качестве профага cts-мутант, находящихся на разных стадиях развития. При этом происходило более синхронное образование фагового потомства, чем при инфекции фагом прорастающих спор. Эти эксперименты позволили показать, что продуктивная индукция фага у таких лизогенов происходит в спорах с короткими проростками. Эта же стадия оказалась чувствительной и к фаговой инфекции.

Параллельно с этими работами шла серьёзная подготовка к осуществлению экспериментов по определению локализации профага на генетической карте штамма S.coelicolor А(3)2, которая была осуществлена Лидой Емельяновой. К этому времени мы уже имели генетически маркированные штаммы S.coelicolor А(3) 2, присланные нам Д. А. Хопвудом. Предварительно Норой Мкртумян были получены мутантыфага, отличающиеся по частоте лизогенизации и по морфологии негативных колоний. В скрещиваниях были использованы лизогенные генетически маркированные штаммы, несущие в качестве профагов эти мутанты. В начале работы необходимо было освоить методы скрещивания актиномицетных штаммов, что потребовало больших усилий. Не вдаваясь в значительные трудности и даже ошибки на этом пути, сайт интеграции профага в хромосому актиномицета был локализован между двумя соседними генами uraA1 и pheA1, расположенными на генетической карте штамма S.coelicolor А(3) 2 (J. Gen. Microbiol., 1973, v. 77: 455–460). Статья опубликована в соавторстве Н. Д. Ломовской, Л. К. Емельяновой, Н. М. Мкртумян и С. И. Алиханяна). Было также продемонстрировано явление зиготной индукции при скрещивании лизогенных и нелизогенных штаммов актиномицетов (Генетика, 1973, 9:103–110, статья в соавторстве Н. Д. Ломовской и Л. К. Емельяновой).

Разработка методов получения количественных данных, характеризующих процесс инфекции актинофагом phiC31 чувствительного штамма S.lividans 66, позволяла приступить к подготовке экспериментов по построению генетической карты этого актинофага. Как правило, для картирования фаговых геномов получают большой набор условно-летальных мутантов, например, температурочувствительных мутантов (ts), которые образуются практически во всех генах, имеющихся в геноме фага. К нашему огорчению, сам фаг phiC31 оказался неспособен расти на высокой (37° С) температуре и сам был ts-мутантом.

Но довольно скоро удалось получить фаг, способный расти при 37° С. Он и явился объектом всех дальнейших исследований. Вся эта работа, включая и построение генетической карты актинофага phiC31, в основном, выпала на долю Тани Чиненовой. Оглядываясь назад, нельзя переоценить тот вклад, который она внесла в изучение генома phiC31, построение его генетической карты. Пришлось разрабатывать специальные приемы для получения данных по комплементации (отнесения мутантов к одному или разным генам) и рекомбинации (расположению мутантов на генетической карте фага) в несинхронизированной по выходу фага системе. Статья, в которой были представлены данные по построению первой генетической карты актинофага phiC31 была опубликована в 1975 году в журнале Генетика, том 11, стр. 132–141. Соавторами этой статьи были Т. А. Чиненова и Н. Д. Ломовская. Все ts-мутанты и другие различные по фенотипу мутанты, за исключением одного, были расположены в линейном порядке по одну сторону от с-мутанта.

Для дальнейшего генетического изучения структуры генома фага phiC31 необходимо было охарактеризовать его физически. Это было сделано Ириной Алексеевной Сладковой, нашей многолетней коллегой, физиком по образованию. В статье, опубликованной в журнале Генетика, т. 13, стр. 342–344, 1977 г. в соавторстве И. А. Сладковой, Н. Д. Ломовской и Т. А. Чиненовой, было показано, что геном актинофага phiC31, также как и геномы большого числа бактериофагов, представляет собой линейную молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), которая была детально охарактеризована и в двух последующих статьях И. А. Сладковой, опубликованных в журн. Молекулярная Биология, 1980, т. 14, стр. 1131–1136 и 1137–1141.

В конце 1970-х годов мы попытались изолировать дополнительно фаги, действующие на штаммы S.coelicolor А(3)2 и S.lividans 66, из имеющейся у нас большой коллекции родственных штаммов актиномицетов, т. к. после обнаружения фага phiC31 мы не предпринимали таких попыток. Два лизогенных штамма были обнаружены Таней Чиненовой. Анализ строения ДНК фагов, образуемых этими лизогенными штаммами, проводился И. А. Сладковой, а их фенотипические и генетические признаки вместе с Таней изучали Лиля Васильченко, Нора Мкртумян, а впоследствии и Ольга Клочкова. Оба обнаруженные фага phiC62 и phiC43 по данным гетеро-дуплексного анализа оказались практически гомологичными фагу phiC31. Фаг phiC31 отличался от фага phiC62 только наличием небольшой делеции. Фаг phiC62 был идентичен фагу phiC31 и по всем проверенным фенотипическим признакам. А вот изучение фага phiC43 принесло нам много интересных фактов. Этот фаг тоже был практически гомологичен фагу phiC31, но имел в отличие от него чужеродную вставку в несущественной для литического развития фага области генома, которая была обнаружена с помощью гетеродуплексного анализа.

Образованные в результате спонтанной индукции лизогенного штамма мутные негативные колонии phiC43 имели разную морфологию. Этот признак, как оказалось, отражал наличие у этих вариантов фага различий в структуре их ДНК. Кроме того, практически все они обладали важным фенотипическим признаком – отсутствием способности к лизогенизации чувствительных штаммов. Так мы впервые столкнулись с появлением актинофаговых мутантов, не способных к интеграции в хромосому актиномицета.

Оказалось, что чужеродная вставка включалась в фаговый ген, контролирующий синтез фермента интегразы. (ж. Генетика, 1979, стр. 1953-62. Соавторы статьи И. А. Сладкова, Т. А. Чиненова, Н. Д. Ломовская и Н. М. Мкртумян). Конечно, мы сразу стали изучать возможность появления делеционных мутантов, образующихся в результате утраты фрагментов фагового генома среди вариантов фага phiC31, изолированных после обработки фага хелатирующими агентами, в том числе, и не способных к поддержанию и к установлению лизогенного состояния. Получение и характеристика большого набора делеционных мутантов фага phiC31, в том числе не способных к поддержанию лизогенного состояния с-мутантов и к установлению лизогенного состояния lyg-мутантов, стало настоящим подарком наших генетиков И. А. Сладковой, блестящему специалисту в области гетеродуплексного анализа ДНК. Первые полученные результаты по локализации делеционных мутантов на физической карте ДНК актинофага phiC31 были опубликованы в журн. Молекулярная Биология, 1980, том 14 стр. 918–915 и 916–921. Соавторами первой статьи были И. А. Сладкова, Л. Г. Васильченко, Н. Д. Ломовская и Н. М. Мкртумян, а второй – И. А. Сладкова, Т. А. Чиненова. Л. Г. Васильченко, Л. Б. Пельтс и Н. Д. Ломовская. Каким же урожайным на публикации статей по физическому и генетическому изучению фага phiC31 оказался 1980 год! Нашими генетиками в дальнейшем было получено и изучено генетически большое число делеционных мутантов актинофага phiC31, различающихся по фенотипам. Представители делеционных мутантов различного фенотипа были локализованы на генетической карте актинофага phiC31 (журн. Генетика, 1981, том 17, стр. 1967–1974, статья в соавторстве Л. Г. Васильченко, Н. М. Мкртумян и Н. Д. Ломовской). Это позволило установить соответствие генетических и физических карт этого актинофага и расположить на физической карте не только делеционные мутанты, но и температурочувствительные и другие мутанты этого фага.

Гетеродуплексный анализ ряда делеционных мутантов фага позволил идентифицировать в геноме фага непрерывную, значительную по длине область фагового генома, не существенную для его литического развития. В этой области среди делеций были локализованы на молекуле ДНК и мутанты в гене, контролирующем синтез фермента интегразы. Идентификация такой несущественной для литического развития фага области его генома открывала большие возможности для конструирования на его основе фаговых векторов, в которых эта область могла быть замещена актиномицетными или другими генами. Неоспоримым преимуществом таких фаговых векторов перед векторами, полученными, например, на основе плазмидных геномов, являлось то, что гибридный фаг, полученный в модельной системе в результате трансфекции гибридной фаговой ДНК штамма S.lividans 66, мог с помощью простой инфекции доставлять чужеродные гены в другие штаммы актиномицетов для осуществления разнообразных задач, таких, например, как идентификация генов антибиотикообразования в штаммах-продуцентах, получения мутаций в этих генах, замены одних генов на другие в геноме актиномицетов и т. д.