Полная версия
Также необходимо четко определить биомаркеры стратификации прогностической эффективности, дозировки и способ введения для каждого конкретного показания.
Серьезный барьер для клинического применения МССК – их функциональная неоднородность, которая зависит от происхождения МССК (первичной биологической ниши), от состояния доноров (возраст, заболевания или неизвестные факторы). Возможно, что на свойствах МСК, их окончательном фенотипе, а соответственно, на направлении дифференцировки отражаются и условия их культивирования (сигналы субстрата, внеклеточного матрикса, количество кислорода).
Пионерскими в этом направлении можно считать работы российских исследователей еще в 2000-х гг. (Цыб и др., 2004), продемонстрировавших возможность получения культуры МССК с высокой клоногенной активностью, способных к дифференцировке в кардиомиобласты. Был показан их регенеративный потенциал в отношении восстановления миокарда, поврежденного химиотерапевтическим воздействием у лабораторных животных. При этом репаративные процессы в наибольшей степени усиливались через 4 нед. от момента введения культуры МСК. Через 1 мес. от трансплантации полученных кардиобластов у реципиентов отмечалось снижение проявлений оксидативного стресса. Эти данные абсолютно однозначно показали, что терапевтический эффект введения несингенных МССК проявляется стимуляцией пролиферации как клеток сердечной мышцы, так и клеток стромы и приводит к восстановлению нормальной гистологической структуры миокарда. Пусковыми в каскаде последовательных регенеративных событий являются изменения, происходящие в периваскулярной зоне миокарда, что, возможно, обусловлено «трофическим воздействием» введенных МССК на резидентные стромальные клетки-предшественники реципиента; это приводит к улучшению микроциркуляции и усилению ангиогенеза. Данные подтверждают существование «трофического эффекта» МСК, т.е. влияние факторов, секретируемых МССК в процессе культивирования (секретом). Эти экспериментальные исследования были подтверждены в клинической практике и повторены в зарубежных многоцентровых исследованиях при ишемической кардиомиопатии (Hare et al., 2012).
Достижение существенных клинических эффектов возможно только в случае создания «управляемых» (не изменяющих направление дифференцировки) гомогенных клеточных культур МСК. Принципиально важными фактами в выработке стратегии получения культуры МССК являются источник их выделения и выбор в пользу аутологичных или аллогенных клеток.
Наиболее изученными и охарактеризованными, по литературным данным, на настоящий момент являются МСК, полученные из костного мозга. В качестве известных источников МССК описаны жировая ткань (Aust et al., 2004), периферическая кровь (He et al., 2007; Smiler et al., 2008), легких, синовиальных жидкостей, периоданальных лигаментов, мышечной ткани (Griffiths et al., 2005; Tuli et al., 2003; Fan et al., 2009; Gay et al., 2007; Jackson et al., 2010).
Изучается потенциал МСК, полученных из плаценты, клеток пуповинной (плацентарной) крови и клеток пупочного канатика и дентальной пульпы (In’t Anker et al., 2004; Miao et al., 2006; Corrao et al., 2013; Erices et al., 2000; Mareschi et al., 2001; Seo et al., 2004; Shi, Gronthos, 2003).
Изучение различных источников получения МССК продемонстрировало целый ряд отличий в их биологических свойствах, протеомном и транскриптомном профилях (Elahi et al., 2016; Kwon et al., 2016; Davies et al., 2017; Chen et al., 2015). Установлены различия в способности формирования клеточных колоний, отличия в мембранном иммунофенотипе (т.н. сурфактоме), в мультилинейной дифференцировке и в паракринных функциях (Billing et al., 2016; Sakaguchi et al., 2005; Rider et al., 2007; Hass et al., 2011; Maleki et al., 2014).
Выявлены некоторые преимущества использования аллогенных МССК перед аутологичными, однако клинический эффект тех и других сопоставим (Trounson, McDonald, 2015; Monsarrat et al., 2016; Atoui, Chiu, 2012; Steinert et al., 2012; Hare et al., 2012).
Важно, что благодаря иммунологической толерантности аллогенные МССК рассматриваются как «универсальные донорские клетки», что определяет существенные преимущества их использования в клинической практике, в т.ч. у онкологических больных.
Экспериментальное изучение влияния МССК в модели сочетанной трансплантации МССК и гемопоэтических стволовых клеток показало эффективность восстановления кроветворения при использовании сублетальных доз циклофосфана (Pavlov et al., 2018; Павлов и др., 2018). На экспериментальных моделях показаны эффективность и безопасность применения МССК в отношении миодистрофий различного генеза (Agrba et al., 2018; Агрба и др., 2018; Гривцова и др., 2020).
В настоящее время продолжается углубленная работа по изучению возможности применения МССК при кардиотоксичности у онкологических больных, серьезного побочного эффекта применения препаратов антрациклинового ряда, обуславливающего повышенный риск заболеваемости и смертности от сердечно-сосудистой патологии у онкологических больных. Современные фармакологические методы лечения кардиомиопатий различного генеза хотя и позволяют замедлять развитие дисфункций миокарда, но имеют ограниченную эффективность у пациентов с терминальной стадией болезни. Многие исследователи полагают, что единственным радикальным способом лечения этой патологии является трансплантация сердца (Dergilev et al., 2020; Дергилев и др., 2020). Достаточно серьезными препятствиями к трансплантации являются нехватка доноров и высокая стоимость операции. Наиболее изученным и привлекательным является применение МСК.
В экспериментальных исследованиях (Grivtsova et al., 2020) было показано, что у животных, получивших МССК до начала введения антрациклинов (доксорубицин 5 мг + МССК до начала введения доксорубицина), зафиксирована нормализация гистоархитектуры мышечной ткани и активация пролиферативной активности стромальных клеток, что свидетельствует о положительном влиянии превентивной трансплантации МССК человека на активацию репаративных процессов в миокарде при антрациклиновой кардиомиопатии. Для этого необходим собственный клеточный биобанк как необходимая инфраструктура для разработки и внедрения клеточной терапии на основе мезенхимальных стволовых клеток в комплексном лечении антрациклиновой кардиотоксичности. (Обзор литературы и данные: Там же.)
По данным многих исследователей, именно сочетание кардиомиобластов и недифференцированных МССК дает наибольший регенеративный эффект (Shudo et al., 2014; Zuppinger et al., 2000; Yoshida et al., 2018).
Получены положительные результаты системных трансплантаций кардиомиобластов и недифференцированных аутологичных и аллогенных МССК костномозговых МССК при проведении комплексной терапии поздних лучевых поражений сердца, развившихся у 16 пациенток после дистанционной лучевой терапии по поводу лимфомы Ходжкина (ЛХ) или рака молочной железы (РМЖ). В результате установлено, что клеточная терапия значительно улучшала эффективность лекарственного лечения, которое ранее было единственным способом терапии лучевых поражений жизненно важных органов. Клинический эффект такой комплексной терапии уже в первый год наблюдения за пациентками проявлялся в уменьшении степени выраженности сердечной недостаточности и улучшении качества жизни больных при отсутствии прогрессирования основного заболевания (лимфома Ходжкина и рак молочной железы) (Kursova et al., 2017; Курсова и др., 2017).
Продемонстрированы возможность, безопасность и эффективность применения костномозговых МССК при язвенном колите и болезни Крона. Установлено, что комбинированная клеточная и антицитокиновая терапия болезни Крона с перианальными поражениями достоверно способствует более частому и длительному закрытию простых свищей по сравнению с антибиотиками (иммуносупрессорами) (Knyazev et al., 2016; Князев и др., 2016; Knyazev et al., 2017; Князев и др., 2017). Также показано, что трансплантация МССК способствует поддержанию более длительной клинической ремиссии у больных с люминальной формой болезни Крона по сравнению с группой больных, страдающих язвенным колитом (Knyazev et al., 2017; Князев и др., 2017; Knyazev et al., 2016; Князев и др., 2016).
Идентификация инициальных МССК чрезвычайно затруднена в силу их малочисленности в тканях, один из возможных путей решения проблемы – применение различных видов клеточной селекции на основании мембранного иммунофенотипа клеток. Использование мембранных антигенов в качестве таргета отбора определяет возможность получения достаточно гомогенной клеточной культуры.
К настоящему моменту установлено, что большинство МССК клеточной культуры экспрессируют эндогликан (CD105), Thy-1 антиген (CD90) и CD73. Данные маркеры признаны Международным обществом клеточной терапии в качестве основных антигенов для идентификации большинства типов МСК. Однако и это не может считаться окончательной рекомендацией ввиду не абсолютной их специфичности в отношении наиболее ранних популяций МСК; экспрессия данных антигенов присутствует на кроветворных (CD105) и эндотелиальных клетках различных этапов дифференцировки (CD90, CD105, CD73).
Типичным для МССК считается отсутствие экспрессии на мембране общелейкоцитарного антигена CD45, маркера стволовых клеток CD34, антигена, специфичного для В-клеток CD19, маркеров, ассоциированных с клетками миеломоноцитарной природы CD14, CD11b, а также антигена главного комплекса гистосовместимости II класса (HLA-DR).
Таким образом, с практической точки зрения возможность терапевтического использования МССК достаточно широка. Мультипотентный потенциал МССК является многообещающим в отношении использования для восстановления трофики тканей и органов даже у кардинально пролеченных онкологических больных на фоне проведения системной комплексной химиолучевой терапии, в частности при кардиомиопатиях и при лучевых повреждениях.
Особое место в лечении неврологических заболеваний занимают нейральные стволовые клетки (НСК) и нейропрогениторные клетки. В определенных специализированных участках головного мозга млекопитающих, в частности в гиппокампе, эпидермальной области или вентрикулярной либо субвентрикулярной зоне, осуществляется выработка пролиферирующих нейральных ПК (НПК). Нейрогенез, происходящий во взрослом мозге, был идентифицирован во многих организмах, начиная от грызунов и заканчивая приматами и людьми. Нейральные ПК обладают способностью к пролиферации и могут дифференцироваться в специфические типы нейронов и нейроглии, что делает их пригодными для привлечения в сферу регенеративной медицины. Нейральные ПК располагаются преимущественно в субвентрикулярной зоне взрослого человеческого мозга, что указывает на то, что головной мозг млекопитающего может производить самоисцеление через механизм рекрутинга эндогенных НПК в случае повреждения или дегенерации. В пределах нервной системы астроциты проявляют значительную гетерогенность (неоднородность), и некоторые классы астроцитов были продемонстрированы как еще один источник НПК (Брюховецкий, Хотимченко, 2019). Помимо существенной вариабельности, которая может наблюдаться в линиях НПК по причине недостатка стандартизации, в соответствии с организмами, в которые трансплантируется этот вид клеток (НПК), различные линии НПК могут проявлять себя разнонаправленным и отличным образом, что помогает объяснить, почему миграция не всегда происходит.
Последние годы определенное место в экспериментальных и клинических исследованиях лечения нервных болезней стали занимать НПК, происходящие из индуцированных полипотентных СК или при помощи трансдифференциации. Нейральные СК и ПК, наделенные аутологичными свойствами, могут быть также получены с помощью стратегий по извлечению индуцированных полипотентных СК или методов трансдифференциации из соматических клеток, например фибробластов, в результате чего возможно избежание этических проблем, связанных с разрушением эмбрионов. Ученым удалось успешно произвести индуцированные полипотентные СК, или НСК, из разнообразных организмов, в т.ч. людей, а индуцированные полипотентные СК, или индуцированные НПК, переносящие информацию о заболевании, также были добыты из фибробластов пациентов. Нейральные ПК, полученные от доноров с патологиями, могут способствовать и ускорять скрининг лекарственных веществ и персонализированной медицины. Кроме того, данные категории НПК не связаны с проблемой отторжения трансплантируемого материала, хотя для клинической осуществимости подобных трансплантаций необходимо преодоление других крупных препятствий, имеющих отношение к безопасности и эффективности.
Особое место в типологии СК занимают клетки, добываемые при помощи методов партеногенеза, ядерного перемещения (трансфера) соматических и измененных соматических клеток, которые схожи по строению с эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК). Ограничения, встречающиеся при использовании в клеточной терапии ЭСК человека, подтолкнули ученых к разработкам других пригодных источников клеток, с применением при этом тех же самых подходов, что и при выработке ЭСК человека. Благодаря достижениям в области репродуктивной биологии методы партеногенеза и ядерного переноса (трансфера) клеток применяются для разработок новейших типов СК, в частности партеногенетических СК или линий ядерного переноса ЭСК. Прибегая к подобным стратегиям, можно конструировать линии мультипотентных СК, напоминающих по своему строению ЭСК. Деривативные производные ядерно перемещенных ЭСК теоретически могут с иммунологической точки зрения соответствовать ядерному донору. Тем не менее, несмотря на запрет данного технического приема, перед применением подобных типов СК по-прежнему возникает этический вопрос, связанный с возможностью продуцирования поддающегося имплантации эмбриона, способного к полноценному развитию. В этой связи метод измененного ядерного переноса (трансфера) смог эволюционировать в более приемлемую альтернативу клонированию, поскольку клетки генетически создаются таким образом, чтобы они могли генерировать дефектные трофобласты и тем самым препятствовать и сдерживать имплантацию эмбрионов.
В целях излечения неврологических болезней при помощи нейральных клеток, происходящих из ЭСК человека, было проведено большое количество доклинических исследований, продемонстрировавших эффективность на животных моделях, варьирующихся от грызунов до приматов. Типы клеток, применяемые в данных работах, включали НПК и терминальные дифференцированные нейральные клетки. Как говорилось выше, МССК также обладают свойствами, которые позволяют им дифференцироваться в клетки, схожие по строению с нейральными клетками, поэтому они играли позитивную роль в улучшении функционирования, будучи трансплантированными в животные модели неврологических заболеваний (Брюховецкий А.С., 2003; Брюховецкий, Хотимченко, 2019).
Нейральные стволовые клетки (НСК), происходящие из других типов полипотентных СК, также подтвердили свою функциональность в доклинических работах. Например, глиально-обогащенные НПК, происходящие из человеческих индуцированных полипотентных СК, были трансплантированы в модели грызунов с боковым амиотрофическим склерозом, опосредованным мутантной супероксиддисмутазой-1. Эти пересаженные клетки затем смогли преобразоваться в астроциты и увеличить жизненный цикл мышей-реципиентов, что указывает на эффективность НСК и глиальных прогениторов, происходящих из индуцированных полипотентных СК человека, при клеточной терапии бокового амиотрофического склероза (Брюховецкий А. С., 2020).
В животных моделях повреждения спинного мозга рестриктированные глиальные клетки-предшественники человека и астроциты на их основе были способны выживать при пересадке в область травмированного спинного мозга, мигрировать в ростральном и каудальном направлениях в область примыкающего белого вещества. При этом данные клетки экспрессировали целый ряд фенотипических маркеров, в т. ч. GFAP (Брюховецкий А. С., 2019). Таким образом, применения одних лишь эмбриональных астроцитов недостаточно для стимулирования функционального восстановления через механизм аксональной регенерации на длительных расстояниях, что предполагает необходимость комбинирования клеточной трансплантации и иных терапевтических интервенционных мер, таких как использование нейротрофинов, cAMP, хондроитиназы. Тем не менее, принимая во внимание значительную неоднородность глии, следует заметить, что не все виды астроглии функционируют одинаковым образом при терапии неврологических расстройств. Как Olig2+клетки-предшественники, извлекаемые из ЭСК человека, так и Olig2— соответственно, могут быть дифференцированы в астроглиальные клетки. Однако при пересадке в крысиную модель ишемического инсульта астроглия Olig2+ выявляла некоторые отличия от Olig2— и смешанных популяций астроглии и приводила к значительному прогрессу функции обучения и памяти крыс с ишемическим инсультом, что свидетельствует о функциональной гетерогенности клеток-предшественников глии.
Однако наиболее изученными, в силу более широкой возможности клинического применения, являются гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), которые дают начало всем кроветворным росткам (эритроидным, гранулоцитарным, мегакариоцитарным, лимфоидным, моноцитарным) и поддерживают гемопоэз в стабильном состоянии на протяжении всей жизни человека. Характерными чертами этих клеток, как и всех СК, являются способность к самоподдержанию, пролиферации и дифференцировке (Чертков и др., 1998; Kondo, 1997). Именно пониманию, что такое ГСК, будет посвящена следующая глава этой книги, а все последующие главы монографии покажут их роль в организме и терапевтический потенциал этих удивительных клеток.
Глава 2. Что такое гемопоэтическая стволовая клетка? (соавт. д.б.н.,
к.м. н. Л.Ю. Гривцова)
Гемопоэтическая стволовая клетка (ГСК), или другое ее название – кроветворная стволовая клетка (КСК), – это клетка-родоначальница всей многомиллиардной системы клеток кроветворения (гемопоэза), всех клеток иммунной системы (иммунопоэза) и главный регуляторный, управляющий и саногенетический инструмент среди всех 256 типов соматических и стволовых клеток в организме человека.
В предыдущей главе мы уже обсуждали тот факт, что ГСК впервые были описаны русским эмигрантом в США проф. А. А. Максимовым в 1908 г. как клетки-родоначальницы кроветворения. А. А. Максимовым было показано, что именно ГСК – это клетки, формирующие гемопоэз, т.е. клетки, лежащие в основе всего процесса кроветворения человека и животных. Но как мощное терапевтическое средство они не получили своего заслуженного признания в нач. ХХ в. Более полувека они были забыты и только в сер. 60-х гг. прошлого века ГСК были успешно применены для лечения острых и хронических лейкозов, лимфолейкозов и миелолейкозов у взрослых и детей путем проведения трансплантации костного мозга (Менткевич, Маякова, 2010). Невероятные успехи в лечении рака крови и даже полное излечение больных от этого онкологического недуга обусловили широкое, но преимущественно одностороннее, с целью поддержки травмированного гемопоэза, применение ГСК в лечении заболеваний человека. Позже, к концу ХХ в., ГСК в большинстве современных исследований широко применялись для восстановительного лечения нарушенного гемопоэза у онкологических пациентов после высокодозной химиотерапии опухолей. ГСК использовались как фундаментальная основа трансплантаций костного мозга в лечении неопластических образований, но прямого противоопухолевого эффекта ГСК на раковые клетки доказано не было (Брюховецкий А. С., 2011).
ГСК с маркерами клеточной поверхности CD34+, CD45+, HLA-DR—, CD38— в организме человека являются самыми универсальными регуляторами гомеостаза, т.к. имеют самый большой период жизненного клеточного цикла (ок. 360 дней) (Пальцев и др., 2009). В свете современных концепций системного подхода к управлению очевидно, что в любом биомолекулярном процессе в организме человека и животных управляющей системой является самая медленная фаза (Неймарк, 1985). С учетом данного факта логично предположить, что CD34+, CD45+, HLA-DR—, CD38— ГСК обладают доминирующими управляющими свойствами среди всех клеточных систем организма и их регуляторные функции являются системообразующими (Брюховецкий А. С., 2010) для всех нормальных клеток организма человека. Также наиболее ранние ГСК, возможно, под влиянием чрезвычайных стимулов способны трансформироваться как в НСК, так и в МСК, что с позиций теории клеточного замещения является крайне важным для реставрации поврежденных тканей.
Функцию обновления и восстановления тканей in vivo выполняют преимущественно тканеспецифические СК, которые представляют собой пул запасных недифференцированных предшественников клеток различных типов (Тепляшин, 2005). Выделены и иммунофенотипически охарактеризованы различные типы тканеспецифических СК взрослого организма – гемопоэтические (CD34+, CD45+) СК (ГСК) (предшественники всех клеток крови), нейрональные (CD133+, СD133—) СК (предшественники клеток нервной ткани) (НСК), мезенхимальные сторомальные (CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34—, CD45— и CD117—) СК (МССК – клетки, способные дифференцироваться в клетки тканей мезенхимального происхождения), а также СК других зародышевых листков.
Самым первым и самым эффективным опытом терапии с использованием СК, позволившим полностью излечить пациентов от рака крови еще в 60-х гг. прошлого века, был опыт применения препарата ГСК при гемобластозах. Путем трансплантации ГСК, полученных из костного мозга донора, удалось заместить все клетки кроветворения (гемопоэза) реципиента и полностью вылечить больного, страдающего острым миелолейкозом (Blood Stem Cell Transplantation, 1998). Сегодня стало очевидно, что ГСК, кроме формирования и восстановления кроветворения, имеют важнейшую регуляторную и системообразующую функцию в организме. В связи с этим считается, что применение биомедицинских клеточных продуктов (БМКП), изготовленных на основе ГСК, является наиболее перспективным направлением в современной медицине (Тупицын и др., 2014; отчет DARPA за 2011). Уже более 100 тыс. пациентов по всему миру получили лицензированный американский препарат «Гемакорд», содержащий ГСК пуповинной крови.
Взрослые ГСК CD34+, CD45+, HLA-DR—, CD38— обладают уникальной способностью направленного трансфера в зону повреждения тканей органа, мигрируя на градиент концентрации воспаления (патотропизм, или хоуминг, ГСК) (Брюховецкий А. С., 2013; Баклаушев, 2015). ГСК, попадая в головной и спинной мозг, являются мощными индукторами синапсогенеза в нервной ткани или участвуют в формировании новых межклеточных контактов в тканях солидных органов (Брюховецкий А. С., 2010, 2013).
Известно, что при пересадке ГСК в различные органы (почки, мозг, печень и т.д.) не наблюдается их прямой дифференцировки в специализированные клетки (кардиомиоциты, миоциты или клетки кожи) этих органов; так трансплантация клеток-предшественников гемопоэза в сердце не приводила к формированию миоцитов. Или их пересадка в слизистую кишечника не восстанавливала секреторную функцию органа. Локальная дифференцировка in situ, как правило, контролировалась «сигналами» микроокружения. Хорошо известна потенциальная возможность трансдифференцировки ГСК в НСК in vitro под воздействием определенных т.н. пертурбогенов (ретиноевая кислота) (Kuroda et al., 2010). Многолетние клинические наблюдения также подтвердили отсутствие аномалий дифференцировки СК в трансплантате. В то же время ГСК обладают функцией целенаправленной миграции к зонам повреждения (Чехонин и др., 2005; Баклаушев и др., 2014). В 2003 г. J. Praice в Англии запатентовал технологию трансплантации ГСК для интрацеребрального введения при лечении поврежденного мозга, которая также рекомендована авторами для использования в терапии болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и болезни Крейтцфельдта – Якоба. Аналогичные свойства целенаправленной миграции к повреждению, хоумингу, патотропизму характерны и другим тканеспецифическим СК и их предшественникам, таким как МССК и НСК (Kaplan, 2006; Snyder et al., 2006).
В настоящее время доказано, что трансплантированные клетки лейкоконцентрата мобилизованных мононуклеаров формировали кластеры ГСК и гемопоэтических клеток-предшественников (ГПК) в ткани поврежденного органа (Ono et al., 1999). В нашей работе было показано, что мультиклеточный кластер мобилизованных МНК, ГСК и ГКП человека после введения в организм (кровь, ликвор, ткань органа) крысы вел себя как системоообразующий по отношению к входящим в него клеткам, и они организованно мигрировали преимущественно (78%) в пострадавший орган, а затем и в зону максимального повреждения и равномерно распределялись в этой зоне (Брюховецкий А. С., 2013). E. Snyder (2005) описал подобный эффект миграции НСК при введении в ткань мозга из правого (интактного) полушария в левое полушарие, где была смоделирована глиальная опухоль мозга мыши за 36 дней. В нашем исследовании повторение данного эксперимента на крысах с глиомой С6 введение лейкоконцентрата мобилизованных мононуклеаров, содержащих ГСК и МСК, занимало 14 дней. Этот феномен может быть ключевым не только в решении вопроса регенерации органов и тканей после повреждения, но и в разработке и создании клеточных препаратов на основе ГСК. Именно клеточный кластер трансплантированных кроветворных клеток имеет важнейшее значение для трансфера этих клеток к месту повреждения, а также целенаправленного распределения их в зоне повреждения патологического органа и адгезии СК к пострадавшим клеткам, оказанию оптимального саногенетического регуляторного и реставрационного воздействия СК и их предшественников на поврежденные клетки.