Полная версия
Теория и практика лабораторных гистологических исследований. Методические рекомендации для преподавателя по организации теоретических занятий
Теория и практика лабораторных гистологических исследований
Методические рекомендации для преподавателя по организации теоретических занятий
Татьяна Юрьевна Белозерова
Татьяна Петровна Зимина
Александр Николаевич Афонин
Благодарности:
Ирина Юрьевна Карева
© Татьяна Юрьевна Белозерова, 2019
© Татьяна Петровна Зимина, 2019
© Александр Николаевич Афонин, 2019
ISBN 978-5-4496-1979-2
Создано в интеллектуальной издательской системе Ridero
Введение
Задачи, которые выполняет в настоящее время патологическая анатомия, ставят ее среди медицинских дисциплин в особое положение: с одной стороны – это теория медицины, которая, раскрывая материальный субстрат болезни, служит клинической практике, с другой стороны – это клиническая морфология для установления диагноза, служащая теории медицины.
Изучение структурных основ болезни происходит на разных уровнях: организменном, системном, органном, тканевом, клеточном, субклеточном и молекулярном. Изучение на тканевом и клеточном уровне осуществляется с помощью микроскопических методов исследования.
В патологоанатомических отделениях клинической морфологией занимаются врачи-патологоанатомы, качество работы которых напрямую зависит от умения среднего звена отделения – медицинских лабораторных техников-гистологов.
Теоретическое занятие 1. Задачи, структура гистологической лаборатории
Технологическая карта теоретического занятия по МДК (ТЗ) №1
Технологическая карта теоретического занятия по МДК (ТЗ) №1
1. Задачи гистологии
Гистология – это наука о строение, развитии и жизнедеятельности ткани многоклеточного организма животного происхождения.
Не вооруженному глазу недоступны объекты, являющиеся предметом изучения науки гистологии. Поэтому история развития науки связана с изобретением оптических приборов. Микроскоп представляет собой систему особым образом шлифованных стекол.
Также развитие науки гистологии связано с развитием гистологической техники, оптики и методов микроскопирования.
Успехи в микроскопических исследованиях давали возможность накопить новые факты и сделать теоретические обобщения. В связи с этим можно различать 3-и этапа развития науки гистологии:
1. Домикроскопический продолжительность его была около 2000 тысяч лет.
2. Микроскопический его продолжительность около 300 лет.
3. Современный связан с развитием электронного микроскопа.
Домикроскопический период.
Гистология как наука о тканях зародилась задолго до создания микроскопа. Впервые попытка анатомического расчленения организма на отдельные части (ткани) была предпринята в трудах Аристотеля (IV век до н. э.), Галена (III век до н. э.), Авиценны (Х век н. э.), Фаллопия (ХVI век н. э.) и др. Этот период продолжался до конца ХVI века, когда французским анатомом М. Ф. Биша были описаны свойства тканей и дана их подробная классификация (21 вид). В этот период создавались общие представления о тканях, как об однородной части организма. Создавались первые классификации тканей. Они проводились на основании физических свойств: тонущие, не тонущие; твердые, мягкие. На основании физических свойств давались не верные классификации, так как в одну группу попадали ткани с разными свойствами. Пример: соединительная вместе с нервной, кровь и лимфа с мышечной.
В 1665 году Робертом Гуком был усовершенствован микроскоп и с помощью микроскопа стало возможным изучать ткани более детально. С этого момента начинается второй период развития науки гистологии.
Микроскопический период.
Основан на разработке методов микроскопирования, гистологических методов и накопления фактического материала.
Первыми микроскопистами были ботаник Грю, анатом Мальпиги, оптик любитель Левенгук, физик Гук, чешский ученый Ян Пуркинье и другие.
Вторая половина XVII века. В этот период с помощью микроскопа описали строение кожи, мышечной ткани, селезенки, описали кровь и так далее. Каждое описание являлось открытием, но не имела системного подхода. Поэтому описания были как отдельно взятые. Не были сделаны существенные выводы в познании закономерностей строения человека, животных и растений.
Серединой XIX века были отмечены изобретения ахроматического микроскопа. Создателями ахроматических микроскопов в России были наши соотечественники Кулибин и Беляев. Были описаны ядра растительных и животных клеток, Различные ткани. Завершением периода были работы Шванна и Шлейдена «Клеточная теория». Все последующие открытия были сделаны на основании клеточной теории. Клеточная теория легла в основу изучения не только нормального строения тканей (эпителиальной, соединительной с кровью, мышечной и нервной), но и патологических изменений тканей и органов («клеточная патология» Р. Вирхова, 1856). Этот период можно разделить на 3-и основных направления гистологии:
1. Цитология – учение о клетках.
2. Общая гистология – учение о тканях, образованных клетками и не клеточными структурами.
3. Микроскопическая анатомия – это наука о тончайшем строении органов.
В начале XIX века особенно бурно развивается гистологическая техника. С древних времен было известно, что применение некоторых жидкостей (спирт, мышьяк, формалин и т.д.), различные масла дают возможность надолго сохранять орган или целый организм. На этом методе было основано бальзамирование известное у древних египтян. Жидкости, применяемые для бальзамирования, стали называться фиксирующими. Позднее в гистологическую технику были введены красители. С помощью красителей стало возможным изучать строение клеток более детально, т.к. клетки и их органеллы по-разному воспринимают красители.
Основным достижением в разработке гистологической техники явилось изобретение микротома. Его изобрел чешский ученый Ян Пуркинье. С помощью микротома можно получить тончайшие пластинки, которые называются срезы. Толщина срезов 1—2 мм.
Современный период
Для современной гистологии характерен функциональный подход к изучаемым структурам, т.е. установление взаимосвязи между строением клеток, тканей, органов и их функциями. Гистология тесно связана с другими науками, прежде всего с медицинскими и биологическими: анатомией, физиологией, биохимией, биофизикой, генетикой и др. Знание нормального строение и функции всех частей тела человека на органном, тканевом, клеточном и субклеточном уровнях необходимы для глубокого понимания изменений, происходящих в организме больного человека. Современный этап характеризуется развитием гистологии в тесной связи с развитием новейших методов исследования: гистохимии, электронной микроскопии и др. Все это позволило дойти до макромолекулярного уровня организации клетки и клеточных структур, уточнить представления о процессах дифференцировки, регенерации, создать основу ультрамикроскопической гистологии и разработать основы молекулярной биологии.
2. Значение гистологии для подготовки медицинских лабораторных техников
Практические занятия по гистологии состоят из двух частей – теоретической и практической. Теоретическая часть позволяет студентам узнать особенности развития, строения и функции клеток, тканей, органов, а также их взаимодействие с другими органами в норме. Практическая часть позволяет освоить строение макроскопических и микроскопических структур, чтобы опознавать их внешний вид при различных окрасках, при сравнении одноименных органов человека и лабораторных животных. Кроме того, студенты получают возможность ознакомиться с микроскопической техникой, освоить правила пользования микроскопом МИКмед-5 в проходящем свете при увеличении х 100 и х 400, и санным микротомом, научиться технике приготовления гистологических препаратов.
3. Методы исследования в гистологии, их значение для медицинской практики
Для изучения клеток и тканей под микроскопом изготавливают гистологические препараты. Основными методами исследования гистологических объектов являются световая и электронная микроскопия, которые широко используются в клинической и экспериментальной практике.
Светооптические микроскопы. Основная оптическая часть микроскопа состоит из объектива и окуляра. Объектив является наиболее ответственной оптической системой, дающей увеличенное изображение предмета. Окуляр – оптическая система, которая служит в качестве лупы при визуальном наблюдении увеличенного изображения предмета, даваемого объективом. Окуляр обычно увеличивает изображение в 5 – 25 раз.
Электронная микроскопия. Электронные микроскопы обладают высокой разрешающей способностью. Другими словами, в электронном микроскопе теоретически возможно повышение разрешающей способности и соответственно увеличение изображения в 150000 раз больше по сравнению со световым микроскопом. Наиболее часто в морфологических исследованиях используются просвечивающие электронные микроскопы, позволяющие получить плоскостное изображение изучаемого объекта. В последние годы активно применяются растровые (сканирующие) электронные микроскопы, способные создавать трехмерные изображение, т.е. получать пространственное изображение структур.
Изучение организма на тканевом и клеточном уровнях требует приготовления гистологических препаратов и их рассмотрения под микроскопом. Цель приготовления гистологического препарата заключается в том, чтобы путем обработки привести исследуемый материал в удобное для изучения под микроскопом состояние, сделать его прозрачным и контрастным.
Чтобы сделать препарат контрастнее и получить возможность хорошо различать отдельные его детали, объект подвергают окрашиванию. При этом пользуются тем, что разные структуры тканей и клеток по-разному реагируют на тот или иной краситель.
Изготовление постоянных препаратов требует довольно большой затраты труден времени, такие препараты можно использовать в течение многих лет. Препараты готовят из небольших целых объектов (тотальные препараты) или срезов; при всех условиях объект или срез должен быть тонким и прозрачным, иначе невозможно его изучение под микроскопом. Изготовление препарата состоит из нескольких этапов.
4. Задачи, структура гистологической лаборатории
Гистологическая (патоморфологическая) лаборатория размещается в типовом или специально приспособленном помещении. Она должна быть оснащена необходимыми оборудованием, инструментами, лабораторной посудой и химическими реактивами. Рабочие помещения лаборатории – комната, в которой производят вырезку секционного, биопсийного или экспериментального материала; рабочая комната лаборантов; комната для размещения аппаратуры и моечная. Рабочие помещения должны быть оснащены приточно-вытяжной вентиляцией. В лаборатории необходимо строго соблюдать правила противопожарной безопасности и работы с летучими и токсичными веществами. В рабочей комнате лаборанта должны быть вытяжной шкаф, химический и физический столы, шкаф и сейф для хранения химических реактивов. Лабораторная мебель, выполненная из древесины, малопригодна для работы со многими токсичными веществами, используемыми в патоморфологии, поскольку затруднена ее последующая санитарная обработка, поэтому предпочтение следует отдавать специальной лабораторной мебели из металла и пластика, которая снабжена выдвижными частями, подводкой воды, вакуума, воздуха и газа. Рабочий стул должен иметь регулируемую высоту сиденья и спинки и легко перемещаться по полу.
Перечень необходимого оборудования лаборатории включает технические и аналитические весы, рН-метр, микротомы (санные, ротационные, замораживающие), криостат или криокит, водяную баню, столик для расплавления парафиновых срезов, комплекты автоматических пипеток, термостаты, холодильники, микроскопы, автоматы для проводки материала.
Теоретическое занятие 2. Оборудование гистологической лаборатории
Технологическая карта теоретического занятия по МДК (ТЗ) №2
Технологическая карта теоретического занятия по МДК (ТЗ) №2
Технологическая карта теоретического занятия по МДК (ТЗ) №2
1. Организация рабочего пространства гистологов
Организация рабочего места во многом определяет эффективность и качество работы лаборанта. Рациональная расстановка и размещение лабораторной посуды, инструментария, необходимых растворов и реактивов позволяют без суеты, с наименьшей затратой усилий выполнить за одно и то же время больший объем работы.
У лаборанта должно быть свое рабочее место, с площадью рабочей поверхности не менее 60 х 120 см. Участок стола, предназначенный для непосредственной работы, следует сделать из влагоустойчивого материала, накрыть стеклом и расположить под ним небольшие листы белой и черной бумаги. Это создает соответствующий фон, который облегчает работу с окрашенными (белый лист) и неокрашенными (черный лист) препаратами.
Достаточная освещенность рабочего места является одним из важнейших условий, так как изготовление гистологических препаратов требует значительного напряжения зрения. Необходимо максимально использовать дневной свет. Лучше ставить стол около окна. Однако даже при достаточном свете рабочее место должно быть оснащено специальным осветителем к микроскопу или настольной лампой (с наклоняющейся верхней частью) для обеспечения освещенности. Недостаток света неблагоприятно сказывается на восприятии цвета препарата и затрудняет оценку качества его окраски.
Лаборант должен содержать, свой стол в надлежащем порядке: не загромождать рабочую поверхность лишней посудой и предметами, не применяемыми в данный момент в работе. В любой гистологической лаборатории применяют большой набор разнообразной лабораторной посуды. Следует принять за правило не оставлять использованную посуду длительное время без промывания. Если нет возможности ее тут же окончательно вымыть, то необходимо ополоснуть и залить водой. Для удаления засохших реактивов требуется значительно больше усилий, а иногда их вовсе невозможно отмыть.
В повседневной работе лаборанту необходимо иметь набор инструментов, за которым необходим тщательный уход. После применения его следует сразу же мыть (если нужно, очищать) и насухо вытирать (или высушивать в сушильном шкафу).
Хранить инструменты следует в определенном месте. Это облегчает их нахождение и экономит рабочее время.
По окончании рабочего дня лаборант обязан проверить, выключены ли электроприборы, с которыми он работал.
2. Виды лабораторной посуды и инструментов
Лабораторная посуда:
1. Банка на штативе с отводной трубкой для дистиллированной воды.
2. Широкогорлые банки с притертыми пробками для составления батарей для проводки материала, для хранения кусочков тканей в фиксирующих жидкостях и т. д.
3. Бюксы – круглые стеклянные стаканчики с притертыми крышками. Применяются для обработки гистологических срезов и маленьких кусочков тканей.
4. Биологические стаканчики – круглые, овальные или четырехугольные, снабжены крышечками. Наборы таких стаканчиков вставляются в специальные штативы и используются в качестве батарей для проводки гистологических срезов, монтированных на предметных стеклах.
5. Колбы (плоскодонные) – в зависимости от емкости используются для приготовления и хранения различных красителей, под дистиллированную воду и др.
6. Чашки Петри – широкие плоские стеклянные чашки с крышками, используются для окраски свободно плавающих срезов.
7. Кюветы – применяют для одновременной окраски нескольких срезов.
8. Кристаллизаторы – для мытья посуды.
9. Часовые стекла – для окрашивания свободно плавающих срезов, нуждающихся в контроле под микроскопом (серебрение нервной ткани).
10. Пипетки – используют для накапывания красителей на срезы.
11. Для хранения канадского бальзама может быть приспособлена любая баночка, в пробку которой воткнута стеклянная палочка.
12. Предметные стекла – прямоугольные стеклянные пластины размером 76 х 26 мм и толщиной 1 мм, предназначенные для размещения гистологических срезов.
13. Покровные стекла – тонкие (0,15 – 0,2 мм) пластинки для покрытия обработанных срезов, расположенных на предметном стекле.
14. Вся используемая лабораторная посуда должна быть снабжена этикетками и рационально размещена, что позволяет избежать ошибок при ее применении.
3. Виды гистологического оборудования (микротомы, гистологический автомат, прибор для окраски препаратов, станция для заливки в парафин, криостат, дополнительное оборудование)
В набор используемых в гистологической лаборатории инструментов входят пинцеты (хирургические, анатомические и глазные), ножницы (анатомические, хирургические и глазные), скальпели, препаровальные иглы, шпатели – прямые и изогнутые металлические лопатки (чаще применяют при приготовлении срезов на замораживающем микротоме и целлоидиновых срезов), хирургические ножи для вырезки материала и ножи с двойным лезвием для получения тонких срезов ткани мозга.
Теоретическое занятие 3. Строение клетки
Технологическая карта теоретического занятия по МДК (ТЗ) №3
Технологическая карта теоретического занятия по МДК (ТЗ) №3
1. Учение о клетке
Клетки – это функциональные и структурные единицы живых организмов.
Организм человека насчитывает приблизительно 1014 клеток. К клеткам живых организмов предъявляется много требований. Пример: клетки должны быть маленькими по размеру (от 6 до 100 мкм). Для того чтобы скорость проходящих импульсов не имитировалась скоростью диффузий реагирующих веществ. Для клеток ткани характерен единый: обмен веществ; особенность строения; определенные функции.
Каждая клетка многоклеточного организма связана с другими клетками. Клетка способна поглощать энергию, осуществлять синтез, воспроизводиться, сокращаться, раздражаться и т. д. Между клеткой и окружающей ее средой происходит постоянный обмен веществ.
Оболочка клетки имеет 2 слоя:
1. Внешний слой, состоящий из полисахаридов, у растений он толстый и называется клеточная стенка; у животных это слой тонкий и называется гликокаликс.
2. Это плазматическая мембрана. Имеет мозаичное строение, состоит из двух слоев фосфолипидов, между которыми, мозаично располагаются белки. Белки часто подвижны, а фосфолипиды имеют 2 части: внешняя часть – гидрофобная, а внутренняя – гидрофильная.
Специальные органеллы.
Обеспечивают специфичность функций клетки. В мышечных клетках это миофибриллы (от лат. mio – мышца, fibrila – спец. органелла), за счет которой мышечная клетка сокращается. В нервных клетках нейрофибрилла, которая обеспечивает чувствительность цитоплазмы. В эпителиальных клетках – тонофибриллы, обеспечивает прочность клетки.
2. Клеточная теория
Ядро растительной клетки наблюдал также английский ботаник Роберт Броун (1773—1858) в 1831 г. Он же открыл «броуновское движение». Ядро —nucleus (лат.), karyon (греч. – ядро ореха). Эти работы послужили основой для создания клеточной теории. Ее сформулировали в 1838—1839 гг. немецкие ученые ботаник Матиас Шлейден (1804—1881) и физиолог, гистолог Теодор Шванн (1810—1882).
Основные положения ее:
1. Все организмы – и растительные, и животные – состоят из клеток; клетка – главная структурная единица живых организмов.
2. В основе роста живых организмов лежат размножение и рост клеток.
3. Шлейден и Шванн считали, что клетки возникают из первичного неструктурированного внеклеточного вещества. Это положение опроверг в 1859 г. немецкий врач Рудольф Вирхов (1821—1902). Он существенно дополнил клеточную теорию положением о том, что клетка происходит только из предсуществующей клетки путем деления («cellulaex cellula»). Клеточная теория обеспечила прорыв в познании структуры и функции живого. Основные ее положения сохраняют свое значение и сегодня.
Основные положения клеточной теории (в современной трактовке).
1. Клетка – элементарная живая система, единица строения, жизнедеятельности, размножения и развития. Вне клетки жизни нет.
2. Новые клетки возникают только путем деления ранее существовавших клеток.
3. Клетки всех организмов сходны по строению; в их состав входят мембраны, цитоплазма и ядро или нуклеоид.
4. Рост и развитие многоклеточного организма – следствие роста и размножения одной или нескольких исходных клеток.
5. Клеточное строение организмов – свидетельство того, что все живое имеет единое происхождение.
Теоретическое занятие 4. Морфофункциональная характеристика структурных компонентов клетки
Технологическая карта теоретического занятия по МДК (ТЗ) №4
Технологическая карта теоретического занятия по МДК (ТЗ) №4
1. Понятие, строение и функции плазмалеммы, цитоплазмы, ядра
Теоретическое занятие 5. Воспроизведение клеток
Технологическая карта теоретического занятия по МДК (ТЗ) №5
Технологическая карта теоретического занятия по МДК (ТЗ) №5
1. Клеточный цикл
Клеточный цикл – это период существования клетки от момента ее образования путем деления материнской клетки до собственного деления или гибели. В. Флеминг сформулировал представление о митозе как циклическом процессе, кульминационным моментом которого является расщепление каждой хромосомы на две дочерние хромосомы и их распределение по двум вновь образующимся клеткам. У одноклеточных организмов продолжительность существования клетки совпадает с продолжительностью жизни организма. В организме многоклеточных животных и растений различаются две группы клеток: постоянно делящиеся (пролиферирующие) и покоящиеся (статичные). В группах пролиферирующих клеток интервал между завершением митоза в исходной клетке и завершением митоза в ее дочерней клетке называется клеточный цикл. Клеточный цикл контролируется определенными генами. Полный клеточный цикл включает интерфазу и собственно митоз. В свою очередь, собственно митоз включает кариокинез (деление ядра) и цитокинез (деление цитоплазмы).
Длительность клеточного цикла
Длительность клеточного цикла у разных клеток варьируется. Быстро размножающиеся клетки взрослых организмов, такие как кроветворные или базальные клетки эпидермиса и тонкой кишки, могут входить в клеточный цикл каждые 12—36 ч. Короткие клеточные циклы (около 30 мин) наблюдаются при быстром дроблении яиц иглокожих, земноводных и других животных. В экспериментальных условиях короткий клеточный цикл (около 20 ч.) имеют многие линии клеточных культур. У большинства активно делящихся клеток длительность периода между митозами составляет примерно 10—24 ч.
2. Определение, фазы митоза
Мито́з (др.-греч. μίτος – нить) – непрямое деление клетки, наиболее распространенный способ репродукции эукариотических клеток. Биологическое значение митоза состоит в строго одинаковом распределении хромосом между дочерними ядрами, что обеспечивает образование генетически идентичных дочерних клеток и сохраняет преемственность в ряду клеточных поколений. Митоз – один из фундаментальных процессов онтогенеза (жизни индивидуального организма).
