Раневой процесс: нанобиотехнологии оптимизации

Раневой процесс: нанобиотехнологии оптимизации

УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АЛТ – аланинаминотрансфераза

АМФ – альвеолярные макрофаги

АО – антиоксидант

АОЖ – антиоксидант липидной природы

АОС – антиоксидантная система

АСТ – аспартатаминотрансфераза

АФК – активные формы кислорода

ГБО – гипербарическая оксигенация

ГГТП – гамма-глутаматтранспептидаза

ГМК – гигантская многоядерная клетка

ГП – гипероксическая проба

ДК – диеновые конъюгаты

ДВС – диссеминированное внутрисосудистое свертывание

ДФПГ – 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил

ИЛ – интерлейкин

Кон А – конканавалин А

ЛДГ – лактатдегидрогеназа

ЛКТ – лизосомально-катионный тест

ЛОК – локальный объемный кровоток

МК-А – модифицированный катапол с акриловой кислотой

МК-М – модифицированный катапол с метакриловой кислотой

НАДН – никотинамидадениндинуклеотид

НАДФН – никотинамидадениндинуклеотидфосфат

НГП – нано-гель-пленка

НСТ-тест – тест нитросинего тетразолия

НЧС – наночастицы серебра

ОТП – обогащенная тромбоцитами плазма

оФП – окисленные флавопротеиды

ПВП – N-поливинилпирролидон

ПВС – поливиниловый спирт

ПЗФ – показатель завершенности фагоцитоза

ПМС – полиметилсилоксан

ПОЛ – перекисное окисление липидов

ПР – губчатое покрытие для лечения ран

ПХО – первичная хирургическая обработка

РП – редокс-потенциал

РТМЛ – реакция торможения миграции лейкоцитов

СВА – супервлагоабсорбент

СОД – супероксиддисмутаза

ТБК – тиобарбитуровая кислота

ФГА – фитогемагглютинин

ФП – фагоцитарный показатель

ФРП – губчатое фуллеренсодержащее раневое покрытие

ФЧ – фагоцитарное число

ХЛсп – спонтанная (базальная) хемилюминесценция

ХЛстим – стимулированная хемилюминесценция

ЦАХ – целлюлоза Acetobacter xylinum

ЦНС – центральная нервная система

ЦХО – цитохромоксидаза

ШУ – шунгитовый углерод

С60/Краун-эфир – кластер фуллерена С60 с 15-Краун-5-эфиром

ATCC – American Type Cultures Collection

С60/ПВП – кластер фуллерена С60 с N-поливинилпирролидоном С60/Tween 80 – кластер фуллерена С60 с полисорбатом 80 (Твин 80)

20-НЕТЕ – 20-гидроксиэйкозатетраеновая кислота

ПРЕДИСЛОВИЕ

Сущность раневого или воспалительного процесса, понятий теоретически и практически почти идентичных, в разной степени известна любому патофизиологу и клиницисту. В то же время в названии книги использован не вошедший еще в повседневное употребление термин «нанобиотехнологии». Поэтому для устранения возможных сомнений начнем с определения этого термина.

Нанотехнология сформировалась как междисциплинарное направление на стыке физики, химии, материаловедения, биологии и электроники. В центре внимания данного направления находятся объекты, размер которых составляет примерно 0,1 – 100 нм (1 нм = =10– 9 м). Слово «нано» (nanos – греч.) в переводе означает «карлик». К нанообъектам относят индивидуальные частицы, пленки, стержни, трубки, сферы, капсулы, а также наноструктурные и нанопористые материалы вместе с нанокомпонентами и наноустройствами. Термин «нанотехнология» впервые использован японским ученым N. Taniguchi в 1974 г. В американской литературе понятие «нанотехнология» трактуется как умение создавать и использовать материалы, устройства и системы, структурные элементы, которые имеют наноразмеры. Одной из приоритетных задач научных исследований в области нанотехнологий является разработка материалов и веществ с заданным высоким уровнем физических, химических, биологических и других свойств. Конечный объект нанотехнологии не одна наночастица, а их совокупность, макроскопическое тело, состоящее из наночастиц, так называемые нанокомпозиты.

Под нанобиотехнологиями понимается слияние молекулярной биологии с инженерией, результатом которого является разработка полифункциональных устройств для биологического и химического анализа, отличающихся высокой чувствительностью и специфичностью, а также высокой скоростью действия.

В настоящее время в результате большого объема исследовательских работ, проведенных зарубежными и отечественными учеными, созданы реальные предпосылки для внедрения нанобиотехнологий в диагностику и интенсивную терапию ряда заболеваний, в контроль над состоянием биологических систем при различных видах патологии, что можно рассматривать как появление нового клинического направления – наномедицины. При этом, несмотря на огромное количество публикаций, в том числе противоречивых, говорить о развитии и внедрении нанобиотехнологий в практическую медицину пока еще преждевременно. По мнению многих исследователей, нанобиотехнологии на сегодняшний день находятся в медленной эволюционной фазе.

В нашей работе в качестве модели для исследования биологической активности нанобиокомпозитов был выбран наиболее доступный для воспроизведения в эксперименте типовой патологический раневой (воспалительный) процесс, развивающийся при многих хирургических заболеваниях, при тяжелой термической и механической травме, в том числе при огнестрельных ранениях. Лечение ран остается одной из наиболее актуальных проблем военно-полевой, гнойной хирургии и комбустиологии. Общее число пострадавших и больных с гнойно-деструктивными процессами мягких тканей и их осложнениями от общего числа больных хирургического профиля составляет 30 – 35 %. Наиболее часто такие процессы наблюдаются при механической травме и, в частности, при огнестрельных ранениях, вызванных снарядами с высокой кинетической энергией, а также при термической и электротравме. Данные виды патологии отличаются длительными сроками заживления ран, высокой частотой неблагоприятных исходов в виде генерализации патологического процесса, инвалидизации, стойкого ограничения трудоспособности. Особое внимание обращает на себя постоянно наблюдающийся рост антибиотикорезистентности микроорганизмов и увеличение частоты гнойно-септических осложнений раневого процесса. При этом ассортимент и доступность отечественных перевязочных средств, многокомпонентно воздействующих на раневой процесс, остаются недостаточными. Для раневого (воспалительного) процесса характерна стадийность течения, когда в ранние сроки после первичного повреждения в тканях развиваются окислительный стресс, метаболический взрыв («пожар обмена») и интенсивная экссудация, вызывающие вторичное (часто по объему превышающее первичное) повреждение тканей, серьезные инфекционные и другие осложнения.

С целью подавления отмеченных сдвигов и воздействия на основные звенья патогенеза раневого процесса было решено исследовать биологическую активность различных комплексов (кластеров) фуллерена С60 (С60/ПВП, С60/Tween 80, С60/Краун-эфир, С60/липоидол). Термин «кластер» рассматривается как химическое соединение (группа атомов), промежуточное между молекулой и твердым телом. Из опубликованных работ известно, что фуллерены перспективны как вещества, оказывающие влияние на окислительно-восстановительные процессы. Опубликованные данные о мембранотропной, цитопротективной, антиоксидантной, иммунотропной, фотодинамической активности фуллерена С60 и отсутствии у него гепатотоксических и цитотоксических эффектов дали нам основание предполагать возможность оптимизации раневого процесса при местном применении данного нанобиокомпозита и его стимулирующего действия на регенерацию тканей.

С учетом непрерывно нарастающей устойчивости раневой микрофлоры даже к III и IV поколению современных антибиотиков важным направлением наших исследований оказалась разработка и изучение эффективности новых наноантисептиков, высокоактивных в отношении первичной («уличной») и госпитальной микрофлоры.

Следующим направлением нашей работы была разработка новых наноструктурных сорбентов, высокоактивных в биологических средах (раневой, плевральный и абдоминальный экссудаты, нативная кровь, плазма крови и др.), и создание на их основе раневых покрытий с адсорбированными препаратами, разносторонне воздействующими на раневой процесс.

Мы надеемся, что результаты исследований, представленные в книге, окажутся полезными для более интенсивного и перспективного внедрения нанобиотехнологий в клиническую практику.

В заключение необходимо заметить, что данная работа, которую ни в коем случае нельзя считать завершенной, не могла быть осуществлена без огромных усилий многих специалистов разного профиля, без непосредственного творческого участия, доброжелательной методической помощи, полезных советов и высококвалифицированных консультаций многих специалистов – представителей смежных и несмежных наук. Среди них с глубокой благодарностью, прежде всего, необходимо отметить доктора биологических наук, профессора Л. Б. Пиотровского (Институт экспериментальной медицины РАМН), доктора биологических наук В. В. Егорову (Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН), доктора медицинских наук, профессора В. Н. Цыгана (Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова). Особую благодарность и признательность мы выражаем В. И. Герасимову (ООО «Научно-производственная фирма „Энергосберегающие технологии и углеродные материалы“», Санкт-Петербург) за безвозмездное обеспечение нашей исследовательской работы водорастворимыми формами фуллерена С60.

Как заметил один из моих незабываемых учителей академик РАН Александр Михайлович Уголев, «когда врач начинает лечение больных, он независимо от его узких интересов становится биотехнологом; при этом биотехнологический подход очень труден, так как он требует использования языка и методов различных наук».

Мы приносим свои извинения за возможные ошибки, допущенные на этом пути, и готовы принять все полезные замечания читателей.

Профессор В. А. Попов

ЧАСТЬ I. РАНЕВОЙ ПРОЦЕСС

Глава 1

ПАТОФИЗИОЛОГИЯ РАНЕВОГО ПРОЦЕССА

Раневой процесс – это сложный комплекс биологических реакций в ответ на повреждение органов и тканей. В ходе него развиваются деструктивные и восстановительные изменения в тканях, образующих рану, и тканях, примыкающих к ней (соединительной, эпителиальной, нервной, мышечной). При этом важнейшая роль принадлежит клеткам крови и нарушениям микрокровообращения. В общей динамике раневого процесса четко прослеживается три основных периода:

1-й период – сосудистых изменений, расплавления некротических масс и очищения от них раневого дефекта через воспаление;

2-й период – пролиферации соединительнотканных элементов и формирования грануляционной ткани, восполняющей рану;

3-й период – фиброзирования грануляционной ткани с образованием рубца и его эпителизацией.

В данном обзоре изложены современные представления о патогенезе воспаления как наиболее важном компоненте раневого процесса, об особенностях локального раневого процесса при таком тяжелом виде повреждения, как огнестрельные ранения, и основные направления патогенетически обоснованного местного лечения ран.

Воспаление – один из самых распространенных патологических процессов наряду с гипоксией и стрессом. Не вызывает сомнения защитная роль воспаления: без него оставались бы не распознанными опасные местные процессы, возникала бы генерализация инфекции, травмы заканчивались шоком, а тканевые дефекты не восстанавливались.

Любой повреждающий агент, который по силе и длительности превосходит адаптационные возможности ткани, может вызвать воспаление (например, длительная экспозиция в кипятке вызывает глубокий ожог, особенно у детей и лиц старческого возраста).

Проблема воспаления исключительно актуальна еще и потому, что свойственные ему закономерности сопровождают раневой процесс, особенно при тяжелой механической травме, наблюдающейся при автокатастрофах, на производстве, при стихийных бедствиях, при огнестрельных пулевых и минно-взрывных ранениях. Ведущим моментом, определяющим степень разрушения тканей, является количество переданной телу кинетической энергии, которое, прежде всего, зависит от скорости ранящего снаряда:

Наиболее разрушительное действие происходит, когда скорость снаряда превышает 600 м/с, а данный показатель у отечественного АК-74, у винтовок США, ФРГ, Бельгии и Италии превышает 1000 м/с. Переход энергии снаряда в среду, характерную для человеческого тела, представляет собой гидродинамический процесс. Встреча ранящего снаряда с тканями – это не только «удар извне», но больше «удар изнутри». Внутритканевой или внутриполостной взрыв, феномен бокового удара – важнейшая отличительная особенность огнестрельных ранений, определяющая обширность повреждения тканей не только по ходу раневого канала, но и далеко за его пределами. В связи с этим особенностью огнестрельных ран покровных тканей человека является их глубина и сложность рельефа.

В патофизиологии воспаления все повреждающие (флогогенные) факторы принято делить на внешние (экзогенные) и внутренние (эндогенные).

Экзогенные факторы:

1. Некробиотические изменения тканей и клеток под влиянием физико-химических факторов – механических и термических воздействий, лучевой энергии (рентгеновские, радиоактивные, ультрафиолетовые лучи).

2. Инвазия чужеродных микроорганизмов или антигенов, иммуногенов во внутреннюю среду. Развитие воспалительного процесса может быть следствием инфицирования организма не только патогенной микрофлорой, но и вирусами, простейшими, а также возникать на фоне активации условно патогенной микрофлоры при снижении специфических иммунологических механизмов защиты и резистентности организма. В развитии острого и хронического воспалительного процесса большую роль играет группа неклостридиальных анаэробных бактерий, которые не образуют спор и являются представителями нормальной аутофлоры человека. Частота выявления анаэробов при острых гнойных заболеваниях колеблется от 40 до 95 % в зависимости от локализации и характера патологического процесса. Существенная роль в этиологии хирургических инфекций отводится облигатным неспорообразующим анаэробным бактериям. В ряде случаев этиологическими факторами инфекционного воспалительного процесса могут быть возбудители, вызывающие развитие особых видов раневой инфекции – клостридиальной (газовая гангрена), неклостридиальной анаэробной и гнилостной инфекции, сибирской язвы, столбняка, рожистого воспаления, актиномикоза, дифтерии, туберкулеза, сифилиса. Указанные возбудители резко изменяют течение воспалительного (раневого) процесса, придают специфику местным и общим проявлениям воспаления.

Эндогенные факторы:

1. Малигнизация собственных клеток организма и реакция на опухоль.

2. Потеря иммунологической толерантности по отношению к клеткам собственного организма.

Воспаление – это системная защитная реакция, преследующая главную биологическую цель – уничтожение и элиминацию всего, что организм считает чужеродным. При достижении этой цели организм, прежде всего, решает следующие промежуточные задачи: локализировать зону воспаления – очаг инфекции, зону некробиотических изменений тканей, клон злокачественных клеток и предотвратить тем самым развитие системной аутоиммунной реакции.

Под чужеродными следует понимать не только инородные частицы или микроорганизмы, попавшие во внутреннюю среду, но и свои некробиотически измененные и переродившиеся клетки, представляющие собой «транзиторный орган внутренней секреции», функционирование которого имеет исключительно патогенное значение. Подвергшиеся цитолизу клетки приобретают свойство антигенной стимуляции системы иммунитета. Изменения наружной клеточной мембраны некробиотически измененных клеток приводят к активации на них системы комплемента по альтернативному пути. Активация системы комплемента вызывает воспаление. Совокупность клеточных, биохимических, физиологических и морфологических процессов, последовательно развивающихся в ране, называется раневым процессом (Зайчик А. Ш., 2005; Литвицкий П. Ф., 2007). С точки зрения общей патологии раневой процесс представляет собой частный вариант воспаления, которое определено как типовой патологический процесс, развивающийся в васкуляризованных органах и тканях в ответ на любое местное повреждение и проявляющийся в виде поэтапных изменений микроциркуляторного русла, крови и стромы органа или ткани, направленных на локализацию, разведение, изоляцию и устранение агента, вызвавшего повреждение, и на восстановление поврежденной ткани (Шанин В. Ю., 1998). В ходе восстановления происходит регенерация или замещение утраченных паренхиматозных элементов органа и/или фиброплазия – замещение дефекта соединительной рубцовой тканью.

Так как раневой процесс является воспалением, то в своем течении он должен проходить стадии альтерации, экссудации и пролиферации. Однако клинически оказалось удобнее выделять следующие его стадии (Шанин В. Ю., 1998):

а) фаза воспаления, включающая период сосудистых изменений и очищения раны;

б) фаза регенерации, в течение которой происходит образование и созревание грануляционной ткани;

в) фаза реорганизации рубца и эпителизации.

Фаза воспаления начинается с момента ранения и длится около 3—4 суток. Совокупность изменений в месте повреждения в период данной фазы характеризуется двумя основными, тесно связанными между собой процессами – альтерацией и экссудацией.

Изменения обмена веществ, физико-химических свойств, структуры, функции клеток и тканей, возникающие в момент повреждения (ранения), называются первичной альтерацией. Повреждение тканей приводит к активации клеток и высвобождению медиаторов воспаления, взаимодействие которых между собой обуславливает развитие местной и системной острой воспалительной реакции.

Медиаторы воспаления имеют как вне-, так и внутриклеточное происхождение и характеризуются определенными функциями (табл. 1).

Помимо медиаторов воспаления существуют биологически активные вещества, предупреждающие их избыточное накопление и действие. Так, относящиеся к таким веществам ферменты – гистаминаза, карбоксипептидаза, эстераза – разрушают соответственно гистамин, кинины, фракции комплемента. Ингибиторы протеолиза ослабляют действие трипсина, глюкокортикоиды снижают выраженность сосудистых реакций и стабилизируют мембраны сосудов. Обмен веществ в очаге воспаления характеризуется преобладанием реакций катаболизма (Литвицкий П. Ф., 2007; Попов В. А., 2003). Происходит перестройка всех видов обмена веществ – углеводного, белкового, жирового и водно-солевого. Активируется гликогенолиз и гликолиз, нарушается образование АТФ, гликолиз переходит на анаэробный путь, вследствие чего происходит накопление избытка лактата и пирувата. Усиление липолиза приводит к чрезмерному образованию свободных высших жирных кислот и кетокислот. В результате указанных изменений развивается метаболический ацидоз. Нарушение баланса между вне- и внутриклеточными ионами значительно увеличивает осмотическое давление внутри клеток и их органелл, что сопровождается перерастяжением и разрывом мембран. Указанные изменения позволили определить состояние метаболизма при воспалении термином «пожар обмена».

Таблица 1

Основные медиаторы воспаления (Литвицкий П. Ф., 2007)

Аналогия заключается не только в том, что обмен веществ в очаге воспаления резко повышен, но и в том, что «горение» происходит не до конца, а с образованием недоокисленных продуктов (полипептиды, жирные кислоты, кетоновые тела), обуславливающих развитие ацидоза.

Продукты первичной альтерации и клетки – участницы воспаления могут вызвать вторичное самоповреждение тканей, получившее название вторичной альтерации. Изменения микроциркуляции в очаге воспаления и прилежащих к нему тканях обуславливают значительное падение напряжения кислорода (Попов В. А., 2003). Гипоксия и связанный с ней гипоэргоз клеточных элементов вызывают развитие гипоксического тканевого некробиоза, который под действием агентов вторичной альтерации переходит в некроз, получивший название вторичного.

Вторичные повреждения тканей могут происходить по кислородзависимому (активные формы кислорода) и кислороднезависимому (гидролитические ферменты, конечный продукт активации комплемента) механизмам.

Кислородзависимые повреждения связаны с массивным образованием лейкоцитами активных кислородных радикалов, приводящих к активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) плазмы крови и клеточных мембран. Показано, что в основе формирования вторичных повреждений тканей в зоне воспаления, особенно в случае огнестрельных и гнойных ран, лежит состояние «окислительного стресса», сущностью которого является активация процессов перекисного окисления липидов на фоне нарушения функционирования системы эндогенной антиоксидантной защиты. Образующиеся при этом активные формы кислорода (АФК) и перекиси, нарастающий протеолиз и местный ацидоз усиливают деструкцию клеток, дистрофические процессы, приводя к увеличению объема повреждения, формированию вторичных некрозов, усилению микроциркуляторных расстройств. Среди АФК наиболее важное значение имеют супероксиданион-радикал (O2 •−), гидроксилрадикал (•ОН), пергидроксильный радикал (НOO•), пероксил-радикал (RОО•) и молекулярный синглетный кислород (1О2). Повреждающие ткани АФК образуются в течение первых часов и достигают своего пика на 4—5-е сутки.

Следует отметить, что уже с момента образования раневого дефекта происходит существенное уменьшение активности сбалансированной эндогенной антиоксидантной системы (АОС). Активность ферментативных и неферментативных компонентов АОС (супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы, аскорбиновой кислоты, витамина А и глутатиона) в условиях неинфицированных ран снижается на 60—70 % в течение первых 7 дней с восстановлением показателей лишь к 14-м суткам. В то же время количество продуктов ПОЛ (малоновый диальдегид) находится на высоком уровне в первые дни и снижается лишь через 14 суток.

Основным кислороднезависимым агентом вторичной альтерации являются гидролитические ферменты, высвобождаемые при некробиотической гибели клеток и при экзоцитозе. Они способны разрушать компоненты межклеточного вещества и клеточные элементы соединительной ткани. Нейтральные протеазы (коллагеназа, эластаза, катепсины, желатиназы) разрушают коллаген, эластин, базальные мембраны. Кислые протеазы вызывают деструкцию гликопротеидов и протеогликанов основного вещества соединительной ткани. Однако известно, что лизосомальные ферменты не способны сами разрушать интактную клеточную стенку и являются потенцирующими веществами более мощных агентов альтерации, а именно активных форм кислорода. Данный факт был подтвержден A. U. Grune (1997), который в своей работе показал, что в присутствии АФК более чем в 50 раз увеличивается активность протеаз.

Помимо гидролитических ферментов к кислороднезависимым факторам относят фактор некроза опухолей, катионные антибиотические белки, лактоферрин, систему комплемента.

Таким образом, среди агентов вторичной альтерации наиболее значимыми в формировании вторичных повреждений являются АФК и гидролитические ферменты. Причем цитотоксическое действие, главным образом, обусловлено АФК, которые за счет индукции ПОЛ приводят к образованию высокомолекулярных хемотаксических факторов, стимулирующих активную миграцию микро- и макрофагов. В результате этого в очаге воспаления накапливаются возбужденные лейкоциты, продуцирующие кислородные радикалы. Одновременно включаются кислороднезависимые механизмы, среди которых наиболее важную роль играют гидролитические ферменты лизосом (нейтральные и кислые протеазы, липазы, гликозидазы). В условиях грубого нарушения гомеостаза, микро- и макроциркуляции, истощения антиоксидантной защиты активация кислородзависимых и кислороднезависимых механизмов вторичной альтерации ведет сначала к расширению территории очага воспаления за счет окружающих тканей, а затем к их повреждению и гибели. Поэтому объем зоны вторичного повреждения всегда больше, чем первичного (Попов В. А., 2003). Так, исследование объема некротических тканей, удаляемых при первичной и вторичной хирургической обработке, показало, что масса погибших тканей за счет вторичного некроза превышает или равна массе некротических тканей, удаляемых при первичной хирургической обработке.

Другим процессом, характеризующим первую фазу раневого процесса, является экссудация, которая представляет собой процесс выхода жидкой части плазмы крови в интерстиций и эмиграцию из сосудов в межклеточные пространства лейкоцитов. Данное явление, главным образом, обусловлено вазодилатацией, замедлением кровотока, резким повышением проницаемости локальной капиллярной сети окружающих рану тканей со сладжированием форменных элементов. В результате этого происходит стаз крови и выход вначале жидкой ее части (транссудата), а затем и крупных белков сыворотки вместе с лейкоцитами (экссудата) за пределы сосудистого русла. В раннем периоде воспаления в экссудате преобладают лейкоциты, позже (на 2—3-и сутки) к ним присоединяются лимфоциты и макрофаги.